• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1984004537A1
    申请号:PCT/EP1984/000124
    申请日:1984-04-26
    公开日:1984-11-22
    发明作者:Urs Haenggi
    申请人:Battelle Institut E V；
    IPC主号:C12N9-00
    专利说明:
    [0001] ==================================================
    [0002] Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen oder Enzymen =================================================
    [0003] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen, insbesondere von Enzymen, bei dem Proteine mit Trägermaterialien verknüpft werden.
    [0004] In weiten Bereichen der chemischen und medizininischen Analytik, der Medizintechnik und der industriellen Produktion von Feinchemikalien ist es wünschenswert, Proteine und Enzyme stabil mit Trägermaterialien zu verknüpfen. So ließe sich z.B. durch fixierte Enzyme, immobilisierte Antikörper oder gebundene Antigene der apparative Aufwand für analytische Tests verkleinern; Oberflächen, die mit physiologischen Systemen in Berührung kommen, könnten durch Proteinbedeckung körperverträglich gemacht werden; durch fixierte Enzyme könnten die Produktionsprozesse kontinuierlich gestaltet werden, was die Kosten für den Katalysator senken und die Abtrennung der Enzyme aus den Produkten überflüssig machen würde. Eine Vielzahl von Immobilisierungsmethoden ist bekannt. Diese bestehen in der physikalischen Adsorption von Proteinen an inerte TrägerSubstanzen, im Einschluß in die Poren von polymeren Gelen, in der Quervernetzung von Proteinen mit bifunktionellen Reagenzien und in der kovalenten Verknüpfung mit einem reaktiven, unlöslichen Träger.
    [0005] Die Verwendbarkeit von proteinbedeckten Materialien und die Standzeiten enzymfixierter Reaktoren hängt wesentlich von der Stabilität der Protein-Trägerverbindung, der
    [0006] Resistenz gegen das Auswaschen und der Regenerierbarkeit des Systems ab. Keine der bekannten Immobilisierungsmethoden liefert ein Produkt, daß allen Anforderungen genügt. Die Gefahr des Auswaschens der Proteine bzw. Enzyme ist gering bei der kovalenten Verknüpfung der Proteine an Träger oder mit sich selbst. Die Verknüpfungsreaktionen beruhen alle darauf, daß die Proteine oder Enzyme über Amino-, Carboxy- oder andere funktionelle Gruppen der Aminosäureseitenketten in rein statistischer Weise mit den Verknupfungsoberflachen oder Trägern reagieren. Dabei läßt sich nicht vermeiden, daß Gruppen, die für die biologische Aktivität verantwortlich sind, ebenfalls reagieren. Damit geht die biologische Aktivität verloren. Die statistische Wahrscheinlichkeit, das biologisch essentielle Gruppe an der Verknüpfungsreaktion beteiligt sind, ist um so größer, je größer die Anzahl der funktionellen Gruppen innerhalb der Aktivitätszentren verglichen mit der Anzahl der Gruppen außerhalb der Zentren der Proteine und Enzyme liegen. Zudem ist das Regenerieren, d.h. der Austausch inaktivierter Proteinmoleküle durch neue, aktive Moleküle praktisch unmöglich. Die Regenerierung bereitet bei adsorptiven Prozessen in der Regel keine Schwierigkeiten. Die Stabilität der Protein-Trägerinteraktion ist jedoch gering. Bei den Einpolymerisierungs verfahren ist die Regenerierung nur in seltenen Fällen möglich. Zudem ist die Auswaschgefahr relativ groß.
    [0007] Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, das die Stabilität der kovalenten Verknüpfung erreicht, ohne daß dadurch die Proteine oder Enzyme inaktiviert werden. Es sollte ein Produkt erhalten werden, in welchem die Verknüpfung reversible gestaltet werden kann.
    [0008] Diese Aufgabe ist erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß in die niσhtessentiellen Teile der Aminosäurensequenzen von Proteinmolekülen auf gentechnischem Wege Blöcke von Aminosäuren mit funktioneilen Seitenketten eingebaut und anschließend die eingebauten Teile mit dem Trägermaterial verknüpft werden. Vorteilhafte Ausführungsformen des Verfahrens sind in den Unteransprüchen 2 bis 5 beschrieben.
    [0009] Die Verteilung der reaktiven Gruppen innerhalb eines Proteinmoleküls ist durch die Aminosäuresequenz bestimmt.
    [0010] Die Reihenfolge der Aminosäuren ist genetisch in der Erbmasse der Gene fixiert und kann mit genetischen Methoden in einem engen Rahmen verändert werden. Diese Methoden lassen jedoch eine gerichtete Veränderung nicht zu, so daß eine deutliche Umverteilung der für die Fixierung der Proteine oder Enzyme verantwortlichen Aminosäuren nur mit aller größtem Aufwand zu erwarten ist.
    [0011] Die bekannten gentechnischen Methoden erlauben es nicht nur, Gene zu isolieren und in andere Organismen zu übertragen, sondern auch Gen-Elemente spezifisch zu verändern, wie z.B. Teile der Information zu deletieren, die information mit anderen Elementen zu ergänzen oder ganze Bereiche zu substituieren. Mit diesen Eingriffen kann das Genprodukt, d.h. das Protein oder Enzym, spezifisch und gerichtet verändert werden.
    [0012] Erfindungsgemäß werden die gentechnischen Methoden dazu benutzt, die Aminosäuresequenzen von Proteinmolekülen so zu verändern, daß die Verteilung der funktioneilen Gruppen, die für die Verknüpfung von Proteinen an Oberflächen oder Trägermaterialien herangezogen werden können, derart gestaltet wird, daß durch die Immbolisierungsreaktion die biologische Aktivität der Proteine möglichst nicht verloren geht. Dazu werden klonierte Gene mit gentechnischen Methoden an einer oder mehreren Stellen geschnitten, die in nichtessentiellen Bereichen der Proteine liegen. In diese Stellen werden Blöcke von vorzugsweise n x 3 Nukleotidpaaren eingebaut, die für eine bestimmte Aminosäure oder Aminosäurefolge kodieren, wobei n eine ganze Zahl ist. Die Nukleotid-Blöcke können z.B. für Lysin, Thyrosin, saure oder andere Aminosäuren mit funktioneilen Seitenketten kodieren. Vorzugsweise werden n x TGT/ACA oder n x TGC/ACG-Blöcke eingebaut. Diese Nukleotide kodieren für Cystein. Hinzu kommen die Randnukleotide, die sicherstellen, daß das Leseraster des Gens nicht verändert wird.
    [0013] Der Einschub der Nukleotidsequenzen in die Gene hat zur Folge, daß bei der Expression der Gene Blöcke von Aminosäuren mit funktionellen Seitenketten in nichtessentielle der Proteine eingebaut werden. Damit verändert sich das Verhältnis der reaktiven Gruppen innerhalb und außerhalb der Aktivitätszentren der Proteinen und der Enzyme derart, daß bei der kovalenten Immobilisierung stark erniedrigte oder keine Inaktivierungsraten zu erwarten sind. Der Einbau von Cysteinblöcken in die Proteine hat überdies den Vorteil, daß die Immobilisierung über Disulfitbrücken erfolgt, die durch einfaches Waschen mit Merkaptanen oder anderen Reduktionsmitteln wieder gelöst werden können. Damit wird erreicht, daß Protein- bzw. Enzymverbindungen mit Oberflächen oder Träger entstehen, die gleichzeitig stabil gegen das Auswaschen sind, ohne daß die Regenierbarkeit verloren geht.
    [0014] Als Träger können alle Materialien eingesetzt werden, die durch an sich bekannte Methoden an der Oberfläche modifizierbar sind oder reaktive Gruppen zur kovalenten Bindung von Anfang an besitzen. Die reversible Verknüpfung erfolgt vorzugsweise durch Oxidation/Reduktionsreaktionen.
    [0015] Die Herstellung eines fusionierten Gens wird im folgenden am Beispiel von ß-Galaktosidase erläutert. Hierzu wird das Gen einer ß-Galaktosidase-Mutante in DNS-Vektoren kloniert und mit EcoRI gespalten. In diese Spaltstelle wird ein Polynukleotid-Doppelstrang mit 6 x TGT/ACA, AATTGT/CA am 5'-Ende und /TTAA am 3'-Ende hineinkloniert. Das so veränderte Gen wird anschließend in Escherichia coli-Bakterien kloniert, das Produkt isoliert und mit einem Träger, dessen Oberfläche zur Einführung von SH-Gruppen modifiziert wurde, durch Oxidation verbunden. Die entstandenen Disulfid-Brücken können durch Reduktion wieder leicht gespalten werden. Dieses Beispiel wird schematisch wie folgt dargestellt.
    [0016] nicht essentiell für Aktivität
    [0017] ThrMetlleThrAsnSerLeuAlaValValLeuGIn - ( N-Termi nus vo n ß-Gal) .. ..ATGACCATGATTACGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA ... (5 ' -Ende des Gens ) . ..TACTGGTACTAATGCTTAAGTGACCGGCAGCAAAATGTT ...
    [0018] Spa l tung mit EcoR I
    [0019] ATGACCATGATTACG AATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA TACTGGTACTAATGCTTAA GTGACCGGCAGCAAAATGTT
    [0020] Insertion von ATTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGT
    [0021] CAACAACAACAACAACAACATTAA
    [0022] ATGACCATGATTACGAATTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA TACTGGTACTAATGCTTAACAACAACAACAACAACAACATTAAGTGACCGGCAGCAAAATGTT
    [0023] ThrMetlleThrAsnCysCysCysCysCysCysCysAsnSerLeuAlaValValLeuGln
    inserierter Bereich (Cys hat -SH)
    权利要求:
    Claims Patentansprüche
    1. Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen, insbesondere von Enzymen, bei dem Proteine mit Trägermaterialien verknüpft werden, dadurch gekennzeichnet, daß in die nichtessentiellen Teile der Aminosäuresequenzen von Proteinmolekülen auf gentechnischem Wege Blöcke von Aminosäuren mit funktioneilen Seitenketten eingebaut und anschließend die eingebauten Teile mit dem Trägermaterial verknüpft werden.
    2. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen des Proteins mindestens ein Mal in einem nichtessentiellen Bereich geöffnet und in diese Öffnung ein Block von Nukleotiden kloniert wird.
    3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß n x 3 Basenpaare, vorzugsweise n x TGT/ACA oder n x TGC/ACG plus Randnukleotide zur Verhinderung einer Veränderung des Leserasters des Gens pro Öffnung kloniert werden, wobei n eine ganze Zahl bedeutet.
    4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das durch Hineinklonieren von Nukleotidpaaren veränderte Gen in einem Mikroorganismus kloniert, nach dem Züchten das veränderte Protein isoliert und auf chemischem Wege kovalent mit einem Trägermaterial verbunden wird.
    5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial durch Einfügung von SH-Gruppen an der Oberfläche modifiziert wird.
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    Robinson2015|Enzymes: principles and biotechnological applications
    CN105209475B|2018-06-12|多重核酸合成的组合物和方法
    Mateo et al.2000|Multifunctional epoxy supports: a new tool to improve the covalent immobilization of proteins. The promotion of physical adsorptions of proteins on the supports before their covalent linkage
    Suekane1982|Immobilization of glucose isomerase
    Hofstee1973|Immobilization of enzymes through non-covalent binding to substituted agaroses
    Sulkowski1985|Purification of proteins by IMAC
    Margolin1996|Novel crystalline catalysts
    US5866341A|1999-02-02|Compositions and methods for screening drug libraries
    US5288609A|1994-02-22|Capture sandwich hybridization method and composition
    US4352884A|1982-10-05|Carrier having acrylate copolymer coating for immobilization of bioactive materials
    JP2873536B2|1999-03-24|プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質を製造する方法
    Tischer et al.1999|Immobilized enzymes: methods and applications
    AU634969B2|1993-03-11|Method and reagents for detecting nucleic acid sequences
    EP0012751B1|1983-07-20|Herstellung von mit trichlor-s-triazin aktivierten trägern
    Klibanov1983|Immobilized enzymes and cells as practical catalysts
    DK175170B1|2004-06-21|Fremgangsmåde og reagenskombination til bestemmmelse af nukleotidsekvenser
    Hawkins et al.1991|Comparison of the activities of protein disulphide-isomerase and thioredoxin in catalysing disulphide isomerization in a protein substrate
    Mosbach2001|Toward the next generation of molecular imprinting with emphasis on the formation, by direct molding, of compounds with biological activity |
    Merrifield1986|Solid phase synthesis
    DE60220893T2|2008-03-06|Verfahren und gelzusammensetzungen zum einkapseln lebender zellen und organischer moleküle
    Bayramoğlu et al.2003|Covalent immobilisation of invertase onto a reactive film composed of 2-hydroxyethyl methacrylate and glycidyl methacrylate: properties and application in a continuous flow system
    Turkova1999|Oriented immobilization of biologically active proteins as a tool for revealing protein interactions and function
    Smith et al.1988|Restoration of activity to catalytically deficient mutants of ribulosebisphosphate carboxylase/oxygenase by aminoethylation.
    Tukel et al.2004|Immobilization and kinetics of catalase onto magnesium silicate
    US4675113A|1987-06-23|Affinity chromatography using dried calcium alginate-magnetite separation media in a magnetically stabilized fluidized bed
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE3316601A1|1984-11-08|
    EP0143807A1|1985-06-12|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1984-11-22| AK| Designated states|Designated state(s): JP US |
    1984-11-22| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): AT BE CH DE FR GB LU NL SE |
    1984-11-22| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1984901761 Country of ref document: EP |
    1985-06-12| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1984901761 Country of ref document: EP |
    1987-01-03| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1984901761 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    [返回顶部]